Kontrol hattı
Immunizing bir konak hayvan antikor ile (s) gelen bir farklı türler üretebilir ikincil antikorlar. Örneğin, enjekte fare içine antikorlar bir hayvan diğer bir fare daha yükseltmek anti-fare ikincil antikorlar. Keçi, eşek, ve tavşan, en yaygın olarak kullanılan konak türler için üreten ikincil antikorlar.
En yaygın türleri ikincil antikorlar vardır bu toplanmış bir karşı oluşturulan nüfus immunoglobulins gelen bir hedef türler.
Örneğin, immunizing bir keçi ile arıtılmış fare IgG üretecektir keçi anti-fare IgG antikorlar olacak tüm bind sınıfları, ağır ve hafif zincirler (H L) ve parçaları fare IgG yanı sıra herhangi bir diğer molekülleri paylaşımı kesinlikle korunmuş etki alanları (e.g., igM payı aynı kappa ışık zincirleri IgG olarak).
Kontrast, immunizing bir keçi ile sadece fare IgG1 antikorlar üretecektir antikorlar özgü fare IgG1 antikorlar ve molekülleri paylaşımı kesinlikle korunmuş etki alanları.
Yüksek derecede çünkü tasarrufu yapısında birçok immunoglobulin etki alanları, sınıf-belirli ikincil antikorlar olmalıdır afinite saflaştırılmış ve çapraz-minimal elde için adsorbe çapraz reaksiyon ile diğer immunoglobulins.
Immobilize fare IgG1 antikorlar arındırmak olabilir tüm keçi antikorlar bu bağlama için fare IgG1 kullanarak yukarıdaki örneğin. Geçit aracılığıyla bir kromatografi sütun (s) içeren fare IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, vb, bu anti-fare IgG1 daha rafine olur antikorlar kaldırmak için herhangi bir çapraz-tepki antikorlar ile non-IgG1 isotypes.
Ayrıca, geçit içeren sütunlar aracılığıyla immobilize serum proteinleri gelen türler diğer daha immunize için kullanılan ev sahibi daha fazla arındırmak ikincil antikorlar. Bu yöntemi çapraz adsorpsiyon (sık sık olarak "son derece çapraz-adsorbe") bir ek arıtma adım için tavsiye uygulamaları kullanırken birincil gelen antikorlar çoklu türler ve zaman immunoglobulins veya diğer serum proteinleri olabilir mevcut örnekleri probed.
Kontrol hattı ürünleri
| Antikor | Uygulama |
| Tavşan IgG | Immunodiagnostic için: ELISA, LFA, CLIA |
| Fare IgG | |
| Fare IgM | |
| Tavuk IgY | |
| Keçi Anti fare IgG | |
| Keçi Anti tavşan IgG | |
| Keçi Anti tavuk IgY | |
| Fare Anti insan IgG |
Isotype kontrol
Isotype kumanda birincil amacı olduğunu olduğunu belirlemek için birincil bağlama antikor belirli olduğunu, yerine olmayan belirli Fc reseptörleri veya diğer proteinler ile etkileşimleri. Aynı zamanda bind antikorlar rekabetçi ve aynı işlevi gerçekleştirmek fonksiyonu-engelleme antikorlar.
, Isotype kumanda birincil kaynağı ile tamamen tutarlı olmalıdır antikor, Ig yazarak, ve etiketleme.
Normal bir serum olarak kullanılabilir bir negatif kontrolü immunofluorescence etiketleme birincil antikor polyclonal olduğunu. Nedeniyle farklı kaynaklardan fluorescently etiketli mAbs, etiketsiz gelen mAbs aynı kaynak olarak kullanılmalıdır isotype kontrolleri ayarlamak için arka plan boyama. Örneğin: örneğin, birincil antikor olduğunu fare anti-sıçan CD11b ve klon öküz-42 arıtılmış IgG, onun isotype fare IgG2a olduğunu, böylece arıtılmış fare IgG2a isotype kontrol olarak kullanılabilir veya öküz-42.
Isotype kontrol: anlamına gelir aynı immunoglobulin subclass olarak Moab içinde unimmunized fareler, gibi faktörler cep autofluorescence, FC reseptör aracılı antikor bağlama, ve olmayan belirli antikor bağlama ağırlıklı olarak kabul edildi. Eğer doğrudan immunofluorescence boyama kullanılır, isotype kumanda floresan pigmentler ile etiketli olmalıdır, gibi IgG1 FITC, IgG2a, PE, vb. Buna ek olarak, isotype kontrol ve Moab-etiketli fluorochrome konsantrasyon ve F:P oranı (etiketli oranı fluorochrome için immunoglobulin molekülleri) aynı olmalıdır en iyi, Hangi doğru ayarı için hayati olduğunu negatif ve pozitif cep simgesel anlamı. Kullanmayın bir isotype kontrol değil maç MoAb, tercihen bir ürün aynı laboratuvar tarafından hazırlanan ve aynı süreci kullanarak veya yöntem (örneğin aynı marka).
Isotype kontrol akış sitometri
Fab fragmanı of antikor olabilir bind için düşük afinite ve olmayan özgüllük ile hücre yüzey, özellikle cep ölü veya hücre zarı hasarlı olduğunu; bu olmayan belirli bağlama daha belirgin olacaktır. Bu nedenle, isotype kontrolleri belirlemek için deneyler genellikle arka plan floresan seviyeleri.
, Isotype kumanda kullanılan bir klasik negatif referans içinde sitometri. Aynı etkiyi elde etmek için çapraz reaktivite arasındaki isotype kontrol ve antikor, isotype, türler, florosein, fluoresein, protein oranı, konsantrasyon, ve diğer göstergeler tutarlı olmalıdır.
Önlemler:
1. Eğer antijen ifade bir iki modlu dağıtım, ve negatif ve pozitif zirveleri ayrılır, deneysel sonuçlar iki modlu dağıtım yoluyla anlayabiliyorum.
2. Eğer kültürlü hücreler tespit gerekir, daha sonra ayarı isotype kontrol bu anda sadece bazı bilgiler elde yansıtan cep yapışma yeteneği, ve bilgi almak için zor olduğunu yansıtan onun olmayan belirli floresan. Bu nedenle, ayarı up bir isotype kumanda algılamak için kültürlü hücreler ideal değildir.
3. Eğer çeşitli floresein kullanılır deney aynı zamanda, sırasında analizi, bu floresan kaçak bulundu sonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahiptir, ve arka plan floresan belirgin değil, isotype kumanda ayarlamak için uygun değildir. Iyi seçim. (FMO kontrolleri hücreleri aynı tür, lekeli ile tüm diğer fluoresceins ile tek floresein kaldırıldı böylece kaçak çeşitli fluoresceins için etiketsiz kanal tecelli olabilir ve kapı yer yerleştirilir, böylece, bir gerekli yolluk için kontrol. Ve FMO kontrol sadece önemli zaman pozitif ve negatif ayırt doğru için gereklidir. FMO kontrol olduğunu şimdi yaygın olarak kullanılan renkli renkli deneyler için deneyler ve gerekli olduğunu.)
4. isotype kumanda kullanırken, bu olmayan bulundu belirli bağlama seviyesi çok yüksek, hangi nedeniyle olabilir bağlama olmayan belirli Fc ucunu cep, olmayan bir özel sinyal sonuçlanan, böylece dikkat Fc engelleme.
5. Bu gerekli isotype kumanda anlamak için sadece bir referans için bize yardımcı filtre dışarı bazı faktörler deney etkileyen, ama biz pozitif ve negatif kesim noktaları belirlemek edemez veya set bir kapısı dayalı bu. Biz biliyoruz gerekir isotype kumanda sadece yansıtmak arka plan floresan olmayan belirli bağlama, ve arka plan floresan da diğer faktörler neden, gibi autofluorescence, yüksek tazminat, antikorlar, etiketleme yöntemleri, aletleri, diğer reaktifler veya veri analizi, ve diğer faktörler arka plan floresan etkileyecek.
6. titrate gereklidir hedef belirli olmayan arka plan floresan azaltmak antikor bağlama, ve bu set için uygun değildir bir isotype kontrol. Nedeniyle aşırı miktarda antikorlar, negatif tepe shift ve taban genişlemesi ortaya çıkar.
7. Eğer hücre sinyalizasyonu ve sitokinler deney tespit vardır,, FMO kontrol ve negatif biyolojik kontrol olmalıdır set, özellikle dikkat unstimulated hücreleri veya hücreleri ile tedavi phosphorylation inhibitörleri.
8. Hücre canlılığı boya eklenir renkli düzeni ölü hücreleri çıkarmak için. Çünkü olmayan belirli hücreleri boyama öldürdü olduğunu extreme, kaldırıldı değilse, bu kurşun için daha yüksek olmayan belirli bağlama ve deney etkilemez.
9. Bu ayarlamak için kullanılabilir diğer kontrolleri yanı sıra isotype kontrol farklı durumlarda. Örneğin, unstained için hücreleri, belirlemek negatif kontrolleri için arka plan ve autofluorescence, set PMT gerilim;
Tam lekeli hücreleri için, belirlemek bazı off-eksen olaylar, set PMT gerilim; için tek-lekeli hücreleri/microspheres, tazminat ayarlamak; unstimulated veya tedavi edilmeyen örnekleri, deneysel negatif kontrol; pozitif hücreleri (özellikle uyarılmış veya ile tedavi ilaçlar), pozitif pratik kontrol.
